Paolo Poli è figlio di un carabiniere. I suoi spettacoli teatrali sono caratterizzati da una forte connotazione comica, rifacendosi alle commedie brillanti, surreali e oniriche. Recita spesso en travesti.
Dopo la laurea in letteratura francese (con una tesi su Henry Becque), inizia ad affermarsi intorno agli anni cinquanta: i primi esordi sono nei piccoli teatri cittadini, come a «La borsa di Arlecchino» di Genova, piccolo teatro d'avanguardia in via XX Settembre (nato anche grazie ad Aldo Trionfo): qui Poli comincia a farsi notare per la sua pungente ironia, il suo garbato istrionismo, la sua vena poetica e surreale contornata da momenti comici e giochi linguistici apprezzati anche da capocomici illustri come Tina Pica e Polidor, con i quali ebbe modo di lavorare.
Nei primi anni sessanta è protagonista di una trasmissione televisiva sulla RAI in cui legge favole per bambini tratte da Esopo e da famosi racconti letterari. È proprio lui, tra le altre cose, sul finire degli anni sessanta, a "scoprire" un giovanissimo Marco Messeri, che difatti può essere considerato teatralmente l'unico vero erede di Poli. Sempre per la RAI, realizza lo sceneggiato " I tre moschettieri", insieme a Marco Messeri, Milena Vukotic e Lucia Poli. Lavora inoltre con Sandra Mondaini in Canzonissima.
Rifiutò, come lui stesso racconta, una parte in 8½ propostagli dall'amico Federico Fellini. Ha diretto come regista ed è stato principale attore di varie opere teatrali, fra cui Aldino mi cali un filino, Rita da Cascia, Caterina De Medici, L'asino d'oro, I viaggi di Gulliver, La leggenda di San Gregorio, Il coturno e la ciabatta, La nemica di Dario Niccodemi. Lo spettacolo Rita da Cascia, che dava una lettura comica e irriverente della storia di Santa Rita, diede vita a molte polemiche, con Oscar Luigi Scalfaro che fece un'interrogazione parlamentare sul caso.
Compiuti gli 80 anni, è ancora attivo e recita nei Sillabari, commedia tratta dai racconti di Goffredo Parise. Ha anche recitato in vari audiolibri, tra cui una edizione di Pinocchio negli anni '70, edita da "Fratelli Fabbri Editori" e composta da 21 dischi a 45 giri. Ha coltivato anche la carriera di cantante, pubblicando un primo singolo nel 1960 e in seguito diversi album veri e propri. Anche sua sorella Lucia è attrice teatrale e cinematografica, e insieme a lei, a partire dagli anni settanta, ha interpretato quattro spettacoli teatrali. È stato in Italia uno dei primi personaggi pubblici dichiaratamente omosessuali.
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