La rappresentazione inizia a sipario calato, con Tonio che, in costume da Taddeo, si presenta come Prologo, fungendo da portavoce dell'autore ed enunciando i principi informatori e la poetica dell'opera. Il Prologo di Pagliacci costituisce un vero e proprio manifesto poetico-programmatico della corrente verista all'interno della giovane scuola italiana (Si può, si può?).
La compagnia di Canio è giunta in un paesino meridionale, Montalto Uffugo in provincia di Cosenza, per inscenare una commedia. Canio non sospetta che la moglie Nedda lo tradisca con Silvio, un contadino del luogo. Tonio, che ama Nedda ma che è da lei respinto, avvisa Canio del tradimento. Questi scopre i due amanti che si promettono amore, ma Silvio fugge senza che Canio lo veda in volto. Canio vorrebbe scagliarsi contro Nedda, ma arriva uno degli attori a sollecitare l'inizio della commedia perché il pubblico aspetta. Canio non può fare altro, nonostante il suo turbamento, che truccarsi e prepararsi per la commedia (Recitar... Vesti la giubba).
Canio, nel ruolo di Pagliaccio, impersona appunto un marito tradito dalla sposa Colombina. La realtà e la finzione finiscono col confondersi, e Canio, nascondendosi dietro il suo personaggio, riprende il discorso interrotto dalla necessità di dare inizio alla commedia e, sempre recitando, rinfaccia a Nedda la sua ingratitudine e trattandola duramente le dice che il suo amore è ormai mutato in odio per la gelosia. Di fronte al rifiuto di Nedda di dire il nome del suo amante, Canio uccide lei e Silvio accorso per soccorrerla. Tonio e Beppe, inorriditi, non intervengono, ma gli spettatori, comprendendo troppo tardi che ciò che stanno vedendo non è più finzione, cercano invano di fermare Canio, che, a delitto compiuto, esclama beffardo: "la commedia è finita!".
